N-氨甲酰谷氨酸緩解豬腸道氧化應激的研究進展

Research Progress of N?Carbamoyl Glutamate in Alleviating Intestinal Oxidative Stress in Pigs

氧化應激是機體氧化還原系統(tǒng)被破壞的一種生理狀態(tài)，引起活性氧自由基在體內(nèi)累積，進而氧化DNA?脂質(zhì)?蛋白質(zhì)等分子的不飽和結構，導致機體代謝紊亂。腸道是機體與外界環(huán)境進行物質(zhì)?信息交換的主要場所，易受環(huán)境中有害菌?病毒等因子刺激，使細胞線粒體內(nèi)活性氧含量急劇增加，造成腸道氧化還原系統(tǒng)失衡，對動物生產(chǎn)性能?生理機能造成不利影響，嚴重時可導致壞死性腸炎?潰瘍等多種腸道疾病發(fā)生，制約豬的正常生長。N-氨甲酰谷氨酸與N-乙酰谷氨酸可激活線粒體中氨基甲酰磷酸合成酶-Ⅰ和吡咯啉-5-羧酸合成酶，促進谷氨酰胺和脯氨酸合成瓜氨酸，而瓜氨酸是合成精氨酸的主要前體，進而促進精氨酸的內(nèi)源合成。近些年，以仔豬?大鼠?羔羊為試驗動物時，發(fā)現(xiàn)NCG在提高機體抗氧化能力?緩解腸道氧化應激方面發(fā)揮關鍵作用。因此，本文總結了NCG緩解腸道氧化應激的可能機理及在生豬生產(chǎn)中的一些應用進展。

在規(guī)模化養(yǎng)殖環(huán)境下，氧化應激是引起豬生產(chǎn)性能降低的主要因素之一。核因子E2相關因子2（Nrf2）和谷胱甘肽是細胞內(nèi)氧化還原平衡的主要調(diào)節(jié)因子，同時也是介導腸道氧化應激反應的主要代謝途徑。Zhang等在羔羊的研究發(fā)現(xiàn)，NCG可以提高腸道Nrf2和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathioneperoxidase，GSH?Px）的表達，同時其與精氨酸代謝關系密切。因此，一般認為NCG是通過介導腸道精氨酸的代謝反應，從而調(diào)節(jié)機體的氧化還原狀態(tài)。

1.1 NCG促進精氨酸合成緩解腸道氧化應激

Ahmad等研究發(fā)現(xiàn)，ROS和丙二醛（ma?londialdehyde，MDA）積累與精氨酸的攝入量呈顯著負相關，表明精氨酸可以參與清除ROS的反應過程。而對于幼齡仔豬而言，線粒體內(nèi)NAG濃度較低，造成精氨酸合成限速酶P5CS的表達受到抑制，相應地限 制了腸道精氨酸的合成效率。然而，NCG具備與NAG相似的代謝途徑，可以在腸道內(nèi)激活P5CS，從而促進精氨酸的穩(wěn)定合成。精氨酸屬于堿性氨基酸，其孤電子對位于胍基基團，與ROS結合后，可以影響機體的氧化還原狀態(tài)。

目前，Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1（KelchlikeECHassociatedprotein1，Keap1）/Nrf2信號通路被認為是緩解豬腸道細胞氧化損傷的重要途徑，在正常生理狀態(tài)下，Keap1可以快速分解Nrf2。Liang等研究表明，精氨酸可抑制大鼠腸道Keap1和泛素連接酶3（CULLIN3）基因的表達，從而抑制Keap1識別和降解Nrf2，提高Nrf2入核數(shù)量；Nrf2也可通過提高谷氨酸半胱氨酸連接酶（glutamatecysteineligase，GCL）和谷氨酸半胱氨酸連接酶（glutamatecysteineligase，GCL）等谷胱甘肽合成酶基因的表達，相應地促進GSH的合成。此外，Mo等研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸能夠上調(diào)大鼠脾臟的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mechanistictargetofrapamycinkinase，mTOR）基因表達，而mTOR是Nrf2的上游信號分子，可能正向調(diào)控Nrf2的表達。此外，Um等研究表明，一氧化氮（NO）也可誘導細胞中Nrf2的表達，可能是通過激活蛋白激酶C（proteinkinaseC，PKC），進而促進Keap1的S-亞硝化，提高Nrf2的表達量。同時，NCG可促進育肥豬機體NO的生成，但是否能激活PKC介導Nrf2的表達還有待進一步研究。因此，一般認為NCG可以介導精氨酸的合成，進而影響Keap1/Nrf2信號通路關鍵蛋白的表達，從而相應地緩解腸道氧化反應（圖1）。

NCG：N-氨甲酰谷氨酸；N?carbamyl glutamate；Arg：精氨酸arginine；mTOR：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白mammalian target of rapamycin；Nrf2：核因子E2相關因子2 nuclear factor erythroid 2?related factor 2；SOD：超氧化物歧化酶superoxide dismutase；CAT：過氧化氫catalase；GSH?Px：谷胱甘肽過氧化酶glutathione peroxidase。

圖 1. NCG 介導 Nrf2 信號通路緩解腸道氧化應激

1.2 NCG介導谷胱甘肽合成途徑緩解腸道氧化應激

谷胱甘肽是谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽，同時也是動物細胞中含量豐富的一類小分子硫醇，在清除自由基、阻止脂質(zhì)過氧化、降低線粒體DNA損傷等方面發(fā)揮作用。谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)是由谷胱甘肽還原型（GSH）和氧化型（GSSG）組成，通過2種形式之間的相互轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)細胞氧化還原平衡。GSH在GSH?Px或谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（glutathioneS?transferase，GST）的作用下，與ROS和脂質(zhì)過氧化物發(fā)生反應后，被氧化為GSSG；而GSSG在谷胱甘肽還原酶（glutathionere?ductase，GR）的作用下被還原成GSH。腸道受到大量ROS脅迫時，GSH與GSSG的動態(tài)平衡被打破，引起機體的氧化反應，研究表明，NCG可調(diào)控谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)，參與清除腸道中的ROS，保護腸上皮細胞免于氧化損傷。

Mo等研究發(fā)現(xiàn)，氧化應激大鼠飼喂NCG后，能夠提高腸道GR的活性，相應地促進GSSG還原為GSH。Zhang等也在報道中指出，NCG可提高空腸GSH?Px的活性，增強機體清除ROS和MDA的能力。另外，GCL和GS是GSH合成的關鍵限速酶，GSH合成酶的激活被認為在調(diào)控氧化應激中發(fā)揮關鍵作用。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，羔羊哺乳期添加NCG，GSH和GSH/GSSG比值在十二指腸?空腸?回腸中的數(shù)值顯著提高，同時小腸MDA含量顯著降低，相應地介導機體的氧化狀態(tài)。然而，關于NCG在調(diào)控豬腸道谷胱甘肽合成的研究相對較少。

1.3 NCG介導NO代謝途徑緩解腸道氧化應激

NO是機體分布廣泛的信號分子，在許多生理和病理過程中發(fā)揮著關鍵的調(diào)控作用。有研究表明，NO在機體代謝中可以清除ROS，在腸道內(nèi)，NO與超氧陰離子（O-2）反應后，生成了過氧亞硝酸鹽（ONOO-），之后轉(zhuǎn)化為NO^-₂和NO^-₃，從而排出體外。另外，NO也是重要的血管擴張劑。在乙酰膽堿作用下，NO由血管內(nèi)皮細胞釋放出來，相應地降低了血管張力，緩解了氧化應激引起的腸道缺氧問題。此外，NO代謝途徑還可激活抗氧化相關因子，調(diào)控機體和細胞的氧化應激反應。在機體中，精氨酸?還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamideadeninedinucleotidephosphate，NADPH）和氧氣在一氧化氮合酶（nitricoxidesynthase，NOS）的催化下合成NO，而NOS是NO的唯 一限速酶；在腸道精氨酸缺乏的情況下，NOS可以催化氧氣生成O^-2，增加ROS的產(chǎn)生。Cai等研究發(fā)現(xiàn)，NCG可通過精氨酸-NO途徑提高豬腸道內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endo?thelianitricoxidesynthase，eNOS）的表達水平，促進機體NO生成。

2.1 NCG用于緩解母豬氧化應激

由于豬缺乏功能性汗腺?體重較大且皮下脂肪較厚，阻礙了自身向外分散熱量，造成體內(nèi)積熱，誘發(fā)熱應激。在母豬妊娠后期和哺乳期，由于機體代謝旺盛而更易出現(xiàn)熱應激。熱應激導致母豬采食量下降?代謝耗能增加，從而導致能量負平衡，使得線粒體功能負荷增加，進而導致氧化應激。氧化應激損傷了母豬機體健康，從而直接或間接地對卵子及胚胎發(fā)育產(chǎn)生不良影響，抑制了母豬繁殖性能的發(fā)揮。也有研究發(fā)現(xiàn)，NCG可以緩解由于氧化應激引起的母豬繁殖性能下降。

Zhu等研究發(fā)現(xiàn)，初產(chǎn)母豬妊娠前期補充NCG，增加了子宮血流量，顯著提高妊娠28d胚胎著床數(shù)和胚胎存活數(shù)，顯著降低胚胎死亡率，提高胚胎著床和發(fā)育相關的蛋白表達，也上調(diào)了eNOS?過氧化還蛋白6（peroxiredoxin6，PRDX6）?熱休克蛋白70（heatshockprotein70，Hsp70）等與抗氧化相關蛋白的表達，表明NCG可以緩解母豬的氧化應激反應。Feng等報道指出，在母豬妊娠后期和哺乳期添加0.05%NCG，可提高仔豬初生窩重和平均活仔重，以及降低母體循環(huán)中的MDA和皮質(zhì)醇含量。Liu等在母豬宮內(nèi)生長受限（IUGR）的研究中發(fā)現(xiàn)，在妊娠期母豬飼糧中添加NCG，可提高臍靜脈血管內(nèi)皮生長因子A（vascularendothelialgrowthfactorA，VEGF?A）和eNOS基因的表達，提高臍靜脈運輸氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的能力，緩解母豬氧化應激引起的宮內(nèi)生長受限。

2.2 NCG用于緩解仔豬氧化應激

仔豬在出生和斷奶階段由于環(huán)境突然變化易導致氧化應激。在出生階段，由從子宮內(nèi)低氧迅速轉(zhuǎn)變到子宮外高氧的環(huán)境中，造成胎兒呼吸系統(tǒng)的線粒體產(chǎn)生大量ROS，然而，新生仔豬體內(nèi)NAG活性較低，體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)無法完全清除ROS。而在14日齡左右，仔豬機體的NAG活性恢復至正常水平；28日齡斷奶階段，仔豬面臨了營養(yǎng)?心理?環(huán)境等多種應激疊加，機體抗氧化酶活性顯著下降，腸道發(fā)生了較高的氧化應激反應，而內(nèi)源精氨酸的合成量仍不足以清除斷奶階段產(chǎn)生的大量ROS。研究發(fā)現(xiàn)，氧化應激會破壞仔豬腸道形態(tài)和免疫功能，對腸道的損傷作用可以一直延續(xù)至成年豬階段，而NCG可直接促進仔豬內(nèi)源精氨酸的合成，有利于緩解仔豬生理階段的氧化應激。

Cai等報道指出，在妊娠早期母豬飼糧中添加0.05%NCG，可改善羊水和血清中谷胱甘肽代謝，緩解ROS對胚胎的脅迫，終保護胚胎免受氧化應激。Zhang等探究了在大腸桿菌應激條件下，NCG對新生仔豬腸道黏膜免疫功能的影響，發(fā)現(xiàn)灌服50mg/kg BW NCG提高了血漿精氨酸和黏膜分泌型免疫球蛋白（SIgA）含量，降低了腸道MDA和過氧化氫含量，從而提高了腸道抗氧化能力和免疫功能。由于NCG在新生仔豬上的應用較少，而補充NCG或精氨酸均可以提高血漿精氨酸含量，且NCG的半衰期較長，相較于精氨酸，能持續(xù)穩(wěn)定增加內(nèi)源精氨酸的合成。此外，在飼糧中使用NCG，還可以避免精氨酸與其他堿性氨基酸吸收時的拮抗作用。

Wu等研究表明，在斷奶仔豬飼糧中添加NCG后，腸道HSP70在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的表達都得到了增強，相應地減少腸道應激反應，從而提高仔豬的生長性能。Yang等研究發(fā)現(xiàn)，在21日齡斷奶的環(huán)江小型豬為研究對象時，飼糧中添加0.1%NCG，血漿精氨酸含量顯著提高，空腸溶質(zhì)載體家族6成員19（solutecarrierfamily6member19，Slc6a19）?溶質(zhì)載體家族7成員9（solutecarrierfamily7member9，Slc7a9）和溶質(zhì)載體家族1成員1（solutecarrierfamily7mem?ber9，Slc1a1）的mRNA豐度顯著提高，相應地影響斷奶仔豬腸道的消化吸收能力。

2.3 NCG用于緩解生長育肥豬氧化應激

在生長育肥豬階段，豬舍飼養(yǎng)密度和衛(wèi)生?冷熱應激?運輸應激和真菌毒素等均會引起氧化應激反應，嚴重時引起生長育肥豬生長性能下降?肉品質(zhì)受損和貨架期縮短等問題。目前，圍繞NCG緩解生長育肥豬氧化應激的研究報道較少，主要集中在調(diào)控生長育肥豬的肉品質(zhì)方面。Yi等研究表明，在生長育肥豬飼糧中添加1%精氨酸可緩解熱應激導致的腸道損傷，提高空腸上皮細胞黏蛋白-2?閉鎖小帶蛋白-1（ZO?1）?阻滯素蛋白的表達，改善了生長育肥豬小腸的屏障功能。Ye等報道指出，低蛋白質(zhì)飼糧添加NCG后，顯著提高了肥育豬的無脂瘦肉增重，同時增加了背長肌的亮氨酸含量。Xing等研究發(fā)現(xiàn)，NCG可以減少寧鄉(xiāng)豬皮下脂肪沉積，提高背長肌油酸?α-亞麻酸和泡桐酸的含量，降低花生四烯酸含量，提升寧鄉(xiāng)豬肉品質(zhì)。

綜上所述，NCG在維持豬腸道精氨酸穩(wěn)態(tài)?調(diào)控腸道氧化平衡狀態(tài)等方面發(fā)揮重要作用，可以緩解由于氧化應激帶來的不同階段豬生產(chǎn)性能下降等問題。由于精氨酸在胃中降解率高，需要包被，導致其使用成本較高。NCG相較于精氨酸在胃液降解率低，添加量小，生產(chǎn)成本低，且不易與賴氨酸?組氨酸等堿性氨基酸產(chǎn)生拮抗作用。然而，NCG在緩解單胃動物氧化應激?調(diào)控腸道細胞增殖的研究較少，此外，大多數(shù)研究局限于NCG對精氨酸的調(diào)控作用，對于NCG調(diào)控精氨酸合成以外的機制幾乎沒有涉及。隨著生物技術手段的不斷發(fā)展，進一步探索NCG調(diào)控單胃動物腸道氧化應激的分子作用機制，有助其更好地應用于畜禽生產(chǎn)。

參考文獻 略